脑声常谈：激光散斑血流成像技术在慢性脑缺血动物模型中的应用

  激光散斑衬比成像(laserspecklecontrastimaging，LSCI)技术能实时成像观察CCH动物模型CBF变动情况，有效判断动物模型CBF的改变及干预方法对CBF的影响，对探索CCH动物模型的造模方法及该病的治疗方法具备极其重大贡献。

  LSCI技术自20世纪90年代推出以来，已大范围的应用于神经科学、皮肤病学和眼科等领域，是测量血流量的有用工具。激光散斑衬比成像系统主要由HeNe激光器、扩束镜、反光镜、光学镜筒、CCD相机及计算机组成，是一种快速、实时、非侵入性和非接触式的成像技术，以高时间和空间分辨率使组织中的体积积分血流图可视化。其利用激光具有相干性的特点，当激光照射血管组织时，血管中的红细胞持续流动，反射回来的光线在成像上的强度不一，从而形成相差。在图像上反映的是红细胞的流速越快，成像就越模糊。因此，流动的红细胞是移动散射体的大多数来自，而血流则充当着虚拟造影剂的角色，从而勾勒出血管的轮廓。系统成像后，可利用计算机通过量化观察到的斑点对比度K中的空间模糊量来测量相对于基线的血流变化，其中K为给定相机曝光时间T下窗口像素强度的标准偏差与平均值的比率。尽管LSCI技术在微循环血流量观察方面是有前途的工具，但其也存在一定的局限性。为促进LSCI技术的广泛应用并改善其局限性，许多研究对该技术进行了优化。多重曝光激光散斑对比成像量化了散斑对比度如何随着曝光时间的增加而降低，并在估计灌注时展现出更真实的光组织相互作用和散斑去相关模型，因此相较于单曝光LSCI其提高了灌注的线性响应，受组织特性的影响较小且主观上成像质量更高。而同步多尺度激光散斑成像可通过大视野和小视野的同时成像获得关键信息，前者为感兴趣的组织提供全局血流动力学信息，而后者则提供局部高分辨率血流信息。线扫描激光散斑对比成像相比于传统表面照明的散斑成像能够检测和量化更小、更深血管中的血流，此外其还能够生成基于深度分辨吸收的组织形态学图像，增强基于血流的功能成像。且随着对激光散斑衬比成像关键技术的进一步研究，一系列新型LSCI系统也应运而生，最重要的包含便携式LSCI、内窥式LSCI、头戴式LSCI、多模态LSCI等，这些新型系统拓宽了该技术的应用场景。LSCI技术在观察血流量方面有其优缺点，但随着该技术的进一步研究，其缺点也在逐渐优化中。

  LSCI技术在脑科学中应用最广泛的就是监测皮层脑血流量，通过对大脑皮层CBF的活体监测，提供客观的图像，在脑缺血疾病模型的研究中发挥着及其重要的作用。目前对CCH模型评价的方法主要有行为学、神经电生理及CBF监测，其中CBF监测是评价CCH模型动物状态的金标准。CCH动物模型主要的模式动物为大、小鼠，且存在多种造模方法，不同的造模方法造成的损伤部位及程度不同。尽管造模方法不同，但模型的成模标准大多相同，通过一系列分析计算动物造模前后CBF的下降比率常作为其成模的标准之一。目前研究多认为其成模标准为CBF在术后3d内下降至基线%或以上。有研究通过长期观察利用双侧颈总动脉狭窄法制备的CCH小鼠模型CBF变化，发现在术后2h脑皮层血流量下降最明显，后逐渐恢复，在术后28d仍较基线%。而利用改良双侧颈总动脉永久性闭塞法(先闭塞一侧颈总动脉间隔1周再闭塞另一侧)制备的CCH大鼠模型CBF在闭塞一侧颈总动脉时下降至基线%，而后CBF逐渐恢复至基线水平，两侧血管都闭塞后CBF急剧下降，并在术后8周CBF恢复至基线水平。有研究探索更年期是否会加剧雌性小鼠慢性脑缺血所致的认知障碍，利用LSCI技术观察更年期CCH模型与对照CCH模型小鼠脑血流量变化，发现二者无明显差异，但证明CBF减少可导致小鼠日常生活能力受损。综上，LSCI技术可作为评价CCH动物模型成模的重要工具，并可对模型造模前后的CBF进行长期观察，判断不同造模方法对动物模型CBF的影响，从而更深入地了解动物模型CBF的变化过程，改进更符合CCH发病过程的造模方法。此外，其还可用于探讨不同干预因素对该疾病动物模型脑血流量的影响，为临床治疗该病提供便利。

  LSCI技术在观察大小鼠动物模型时有所不同。小鼠因其颅骨骨质较薄，其皮层血管清晰可见，因此打开其头皮即可成像，是激光散斑衬比成像常用的模式动物。与小鼠不同，大鼠的颅骨较厚需利用小动物颅钻将其磨薄才能观察到清晰的血流图。因此在观察大鼠模型时，人工磨薄程度的差异，也会在某些特定的程度影响CBF的观察。若要长期观察大鼠模型的CBF变化，还须时刻注意磨薄颅窗的愈合情况，在颅骨愈合增厚时要及时磨薄。此外，在保持硬脑膜的完整情况下也可手术去除大鼠颅骨，再利用盖玻片建立人工颅窗以避免颅骨愈合影响对脑血流的观察，但手术操作难度大且动物死亡率会增加。LSCI技术可实时、非接触式的活体成像，但颅骨等静态散射成分也会影响脑血流量的监测，且因其穿透深度约为300μm只能检测脑皮层血流量，所以对于受缺血影响更大的白质及海马供血情况尚无法检测。而皮层表浅血管容易受自身及外因影响，自身因素包括动物自身的应激情况、血压、血气等，而外因则包括温度、麻药的种类及麻醉的程度等。值得一提的是，呼吸麻醉剂异氟醚的使用会改善CBF并增加局灶性缺血区O2的供应和消耗。因此在利用LSCI技术观察动物模型CBF变化时要严控麻药的种类统一。

  神经血管耦合将大脑的高能量需求与血液中的能量底物供应相匹配，是健康大脑的基本功能，其可靠性也是临床和科研使用非侵入性脑成像技术的基础。而神经血管耦合调节CBF在维持健康的认知功能方面也起着至关重要的作用。目前已有许多技术应用于神经血管耦合的观察中，包括功能磁共振成像、功能近红外光谱技术、正电子发射计算机断层成像和功能超声等。而LSCI技术是评价神经血管耦合功能的新兴技术，其可通过散斑成像及脑血流量分析，呈现更直观、客观的结果。有研究通过LSCI技术发现老年小鼠的神经血管耦合反应受损明显，而利用聚腺苷二磷酸－核糖聚合酶抑制剂PJ-34治疗2周后可通过增加内皮NO(nitricoxide)介导的血管舒张来改善该反应，从而显著改善其空间工作记忆。类似于上述研究，目前LSCI技术对神经血管耦合反应的观察多集中于老年小鼠，通过该技术判断不同干预因素对老年小鼠神经血管耦合反应及认知功能的影响。

  脑侧支循环为血液到达缺血组织提供了另一种血管通路，并已被证实与缺血性疾病更好的临床结局有关。脑侧支循环大体上分为三级，初级侧支为连接大脑前后循环的颅底动脉环;次级侧支为软脑膜侧支即大脑中动脉与大脑前动脉及大脑后动脉远端节段之间形成的侧支吻合;三级侧支是指新生血管构成的侧支循环。其中软脑膜侧支供应被认为是狭窄闭塞性血管病变预防慢性缺血脑组织损伤的关键。侧支循环开放后，其直径及弯曲度会增加，且软脑膜侧支的开放可出现在皮质的所有区域。有研究通过LSCI技术及双光子激光扫描显微镜观察缺血区域脑血流量、血管直径和单个侧支的血流方向及速度发现远端缺血预处理可改善老年缺血性卒中大鼠侧支衰竭，来提升缺血区域脑灌注，减少脑组织损伤。LSCI技术已被应用于观察缺血性卒中脑侧支循环的建立，对于同样是脑缺血疾病的CCH来说，利用其观察CCH中侧支循环的建立及评价不同干预方法对脑侧支循环开放的影响可能是研究CCH治疗方法的有效策略。然而相较于缺血性卒中模型单侧大脑中动脉的闭塞而言，CCH模型侧支循环观察的范围要更广，实验耗时要更长。且LSCI技术只能观察到皮层的侧支开放，对于颅底及大脑深部的侧支无法观察。

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