《自然—方法学》特写：无需标记的激光特技

  哈佛大学的Brian Saar，Gary Holtom和谢晓亮教授（从左至右）发展了非线性显微成像技术和应用。

  一个富含蛋白质的毛发及其周围的富含脂肪的皮脂腺。该图像是通过受激拉曼散射方法采集的，绿色为脂肪，蓝色为蛋白质。

  最近出版的《自然方法学》刊登特写文章《无需标记的激光特技》（Laser tricks without labels），称非线性光学显微术可帮助科学家看到活体细胞和组织中的化学组成。文章的主要内容如下：

  两年前，Annika Enejder在她关于线虫的脂肪贮存研究中，遇到一个令人困惑的结果。荧光显微图像非常清晰地表明，在用他汀类药物处理这些蛔虫时，来自脂肪粒的信号将降低。他汀类药物是一类被大范围的使用在降低胆固醇的药物。然而，在一起进行的另一种显微实验中，直接观察脂肪颗粒却看不到这样的变化。实际上，相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术能够识别出脂肪颗粒，而荧光显微技术做不到。

  其实是这么回事，用常用的Nile red荧光染料饲喂的线虫把这种染料当作毒物处理了：染料被隔离到脂肪粒周围的肠类溶酶体颗粒中，而不是脂肪粒中。实际上，这种染料还在别的方面具有误导性：他汀类本身似乎会影响它的染色或者荧光。“在使用荧光基团的时候，有很多假象要考虑到。” 来自位于瑞典查尔姆斯理工大学的Enejder说。

  没人能够否定荧光探针和分子染色在细胞内行为探测上的实力，但是这种标记办法仍然有诸多问题。如何标记是一个问题，尤其是对整个有机体而言。有些标记只能在已死亡的细胞内有作用；其他的标记标记方法则会损伤细胞，或者干扰所研究的生物过程。非标记的显微技术提供了一种能够大幅度降低人为干扰的活体观察技术。虽然有些技术仍然依赖内源性荧光基团，不过它们基本上可以摒弃荧光技术，也就避免遇到光漂白这个普遍的问题。这些新技术探测的是光在通过生物样品时被吸收或改变时发生的微小变化，而不是探测被激发荧光基团的光子。这种办法依赖在高光功率密度下观察到的非线性光学过程。一言以蔽之，激光脉冲可以被用来“看”化学组成：脂质里面的C-H键，蛋白质里的酰胺键，还原态或者氧化态的生物分子，胶凝蛋白或者微管里面有规律地重复的单元。

  当然，这样的技术也自有其局限性：与荧光标记能够识别单分子相比，非标记技术的灵敏度和特异性都要弱一些。只有特别常见的基团才不会淹没在一些丰富样品产生的信号当中。“这种技术的好处是，你不需要任何标记，你只需要去成像就行了”，荷兰癌症研究所（Netherlands Cancer Institute）的生物物理学家Kees Jalink解释道，“但是不好的地方是，信号太弱了，你需要大量能量来照射一个细胞，而可能仅仅得到一些粗枝大叶的细节。

  除CARS以外，其他可用的非标记手段包括双光子吸收，二次谐波产生（SHG）以及受激拉曼散射，每一种都有自己的配置需求和优势。然而，这些手段并没有在生物学家中间闪电般地传播开。昂贵的激光需要被耦合进显微镜；光的短脉冲需要精确的瞄准、调整和整形；探测器必须被优化，从而能够拾取信号，舍去背景。“组装这些仪器需要丰富的专业经验；这些仪器都要求苛刻”，供职于加拿大不列颠哥伦 比亚大学化学与工程系的Robin F.B. Turner这样评价。而仅仅搭建仪器是不够的。“你得根据每天的情况重新校准”，Turner补充道。

  Turner说，他有充分的理由跟踪这些技术：他想知道干细胞在分化成其它细胞的时候，其中的组分如何变化，而且再也没比这个更好的办法能研究这样的一个问题了。“我们之所以选择拉曼和CARS，是因为它们能够做这种研究而不损伤细胞”，他说。其它研究手段都会毁损细胞，得到的仅仅是在某个时间点上的一个瞬间状况；这样的数据对于包含自发分裂细胞的异质性细胞培养并不是十分有用，Turner补充道，“我们想追踪细胞的生长”。

  同样的优势在组织层次的研究上也很突出。比如，哈佛大学的Gary Ruvkun通过对线虫诱导RNA干扰筛选来研究上千个基因在脂质生成中的角色，同时通过一种叫做受激拉曼散射（SRS）的技术来监视这些结果。

  Ruvkun的合作者谢晓亮教授也来自哈佛大学。大约十年前，谢晓亮因为发布了CARS显微术而引发了巨大轰动。这种技术通过一种叫做自发拉曼散射的现象来增强信号。在自发拉曼散射中，样品内的化学键能够改变通过其中的光的波长。更早使用的拉曼散射显微术要求的激光功率很高，而且有时候需要曝光时间长达一天。谢晓亮和他的同事证明，CARS能够适用于活细胞研究。利用两束激光，它们的频率差等于需要成像化学键的振动频率，细胞产生的微弱的拉曼信号能够被不断放大。“它的灵敏度比自发拉曼散射的灵敏度较高了好几个数量级”，谢晓亮说。但是CARS也有缺陷。在同一时间里，它只集中在很宽的拉曼谱中很短的一段，限制了所能采集的信号的数量；同时还带来了很高的背景信号。从实用的角度讲，这些限制意味着如果要应用CARS技术，大部分时间要基于对脂质的探测，因为碳氢键的大量富集能够产生很强的特征信号。

  谢晓亮的兴趣已经转移到了SRS，这是他和他的组员闵玮、Christian Freudiger一起发展出来的技术，相关论文于2008年发表。“在CARS里面，信号峰位发生了移动，”谢晓亮解释道，“这意味这咱们不可以使用现有的、数量巨大的拉曼谱数据来进行化学鉴定。”他还讲到，与此相比，SRS可以通过对激光异常迅速和精确地调制来去除背景噪音。这样一来，不仅仅可以得到与传统拉曼光谱一样的谱图，而且信号强度高了几个数量级，采集时间也远低于未经放大的拉曼信号。谢晓亮说，更妙的是，SRS产生的信号与振动化学键的数量是线性关系，这使得SRS可以有效的进行定量分析。SRS技术能应用于实时观测：比如在在药物和化妆品研究领域，观察维生素A酸是如何被皮肤吸收的。SRS技术还能够适用于观测酸或者酶是如何从植物细胞壁表面去除木质素，来提升生物燃料的生产效率。

  谢晓亮最早是通过与Pfizer以及哈佛研究者的合作研究获得对该技术的原理的证据的。谢晓亮甚至预言，SRS技术有一天会取代CARS技术，然而其他研究人员对此有所保留。SRS需要对多个光源的信号进行混合和解读，而谱的叠加也会使去卷积变得困难。Turner说，他曾经尝试用SRS观察溶液中的核酸，最后还是决定接着使用原来的老技术。利用那些老技术，就可以从细胞的DNA里分辨出RNA。他说，尽管拉曼显微镜可能慢一些，“但是应用SRS技术来扩展我们的知识也挺费劲的，跟使用传统拉曼技术差不多。”

  谢晓亮预计，一旦SRS被植入商用系统，很快就会传播开来，他认为早在今年底之前就会取得这样的进展；据报道，蔡司和徕卡已经于去年获得这项技术的授权。然而，就像荧光显微镜的前车之鉴，技术的传播可能相当缓慢。第一台商用多光子显微镜于1996年发布；而2003年的一项调查发现，66%使用多光子显微镜的生物学研究仍然使用定制系统。现在，商用多光子显微镜则相当普遍。

  2009年10月，适逢谢晓亮的文章发表十年，奥林巴斯宣布要提供能安装在多光子显微镜系统上的femtoCARS模块。2010年1月，Newport公司展示了可以附接到激光和多光子显微镜上的波长扩展单元，用以支持CARS、SHG以及其他成像方式。据悉，徕卡也将于下半年推出自己的产品。奥林巴斯的产品经理YiWei（Kevin）Jia宣称，早在飞秒femtoCARS模块发布之前，他已经在帮助各个研究组着手搭建CARS系统；而这个用来探测脂肪的模块能够让起步更容易。他说，如果CARS的商业化产品推广像多光子显微镜一样，那么销售则能在数年之内有一个大的飞跃。不过目前大多数应用CARS显微技术的主要还是物理实验室，而且使用的是自己搭建的系统。

  不过，这些研究人员慢慢的开始和生物学家们合作。在普渡大学，生物医学工程教授程继新利用CARS在细胞中迅速地寻找脂肪体，然后使用同样的光源，切换到共聚焦拉曼来做同一个区域更详细的化学成分分析。新近关于人类前列腺肿瘤细胞的研究发现，先前被认为由脂肪组成的区域，其实就是被氧化的脂肪酸。下一步是考察这种脂肪酸会否能够适用于标记前列腺癌的严重性。在别的项目中，程继新已发展了一个平台，可自动收集CARS信号的来观测脂肪，还利用一种叫做和频产生的技术看到特定的蛋白纤维。有了这种技术，程继新及其合作者们可以研究富脂免疫细胞如何将自己嵌入到血管壁的胶原蛋白基质中去的这类观测可以揭示动脉粥样硬化中的血块是如何形成的。程继新和他的同事还独立监测了多发性硬化症的老鼠模型中的神经元髓鞘，并且精确地指出是轴突的某个地方出现了损伤。他说，“以前在活体组织中对髓鞘的监测是没有很好的方法达到单细胞水平的。”

  Jalink说，髓鞘因为紧密堆积了大量脂质，很适合用CARS成像。非标记显微技术在别的方面的应用则可能没那么容易。他说常常使用激光器的研究人员很可能会想办法采用这样的技术，他补充道，“技术上讲，这是完全可行的，但是如果我能用另一种方式来获得同样的信息，我为何需要采用这个多少有些复杂而且昂贵的技术呢？”

  技术一旦发展起来，研究人员就能把它们应用到新的方面。哥伦比亚大学的Rafael Yuste利用光学手段来测量神经电位。二次谐波发生（SHG）成像技术依赖于排列非常规则的分子产生的超散射光。这些分子具有极强的诱导偶极矩，或者特定的电荷分布。Yuste对位于神经元细胞膜这类分子非常感兴趣因为电场贯穿其中。由于二次谐波信号和电场强度直接成比例，因而可以自动获得电压信号。

  问题在于，能够很好地实现这一目标的分子非常少。为了达到好的效果，Yuste说，“你需要非常仔细地去扫描全谱，来寻找潜在的内源性二次谐波发色基团。”他说，发展这种技术需要依赖学科交叉，需要研究人员在他们研究领域的边缘工作。但是在现实中，这种工作往往在研究者们自己的系里得不到足够的资金和支持，这也是为什么可以在一定程度上完成这一目标的分子资源较少的原因。

  Enejder等人相信，学科交叉可以帮助人们解决大量只能由非标记的非线性显微技术来观测的问题。虽然Enejder的背景的是物理学，她还是转到了生物系。因为在那里可以更容易的了解生物学家们在成像上到底遇到了什么样的问题，非线性光学怎么样才可以帮得上忙。她说，那些把自己的眼光牢牢地局限在物理系内部的人能够继续优化技术，但是他们或许不了解生物学家到底希望看到什么：“我就绝对没这个问题。在我眼里，应用随处可见。”

  当这样的交流变得日益重要的时候，对新实验的大胆尝试也变得重要起来而这些实验与物理学家们以往的经验可能截然不同。在一项旨在制造弹性血管的生物工程项目中，Enejder和同事们想要监测植入纤维素基质的肌肉细胞的生长。与CARS一起，Enedjer和同事们利用SHG观察了植入的细胞。他们很高兴地发现，自己能监测到被植入细胞是如何与纤维素网进行接触，开始生成胶原蛋白纤维的。在组织工程研究中，这种办法能够大大帮助确定最优参数。尽管纸张中的植物纤维素SHG成像看不到，但是细菌分泌的植物纤维素确实拥有一种有规律的模式，能够产生SHG信号，Enejder解释说，“仅仅依赖别人文章里说的哪些可以观测是不行的，你得自己去试才行。”（陈涛、何姣/编译报道）